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基因工程中“检测目的基因是否进入到受体细胞”方法的的简单步骤(仅限于高中水平了解)  

2012-05-06 13:19:32|  分类: 疑难分析 |  标签: |举报 |字号 订阅

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检测目的基因是否进入到受体细胞的方法,一般包括分子水平检测和个体水平检测。其中分子检测有3个层次:

1.目的基因是否整合到受体细胞染色体DNA;

2.目的基因是否转录出MRNA;

3.目的基因是否翻译出蛋白质。

前两种方法都采用利用DNA变性与复性的分子杂交(molecular hybridization)。所谓分子杂交是指用一个DNA单链与另一被测DNA单链或RNA单链杂交形成双链,以测定某特异顺序是否存在的方法。常用的核酸分子杂交包括Southern杂交DNA/DNA分子杂交)和Northern杂交DNA/RNA分子杂交),二者的方法大致相似:基本做法是:第一步,将受体生物DNA或RNA(或mRNA)提取出来,经过适当的酶切后,走琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的片段分开;第二步,将凝胶上的(DNA或RNA)片段转移到硝酸纤维素膜上;第三步,用标记了放射性同位素(或生物素)的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交;第四步,将X光底片压在硝酸纤维素膜上,在暗处使底片感光;第五步,将X光底片冲洗,如果在底片上出现黑色条带,则表明受体植物染色体DNA上有目的基因。Southern杂交主要用于制作染色体的物理图谱,限制性片段长度多态性,转基因生物的分子鉴定等。Northern杂交可以用于检测某基因表达的时空特异性。

基因工程中“检测目的基因是否进入到受体细胞”方法的的简单步骤 - 桓 - 桓的博客
基因工程中“检测目的基因是否进入到受体细胞”方法的的简单步骤 - 桓 - 桓的博客
  

第三种检测目的基因是否翻译出蛋白质的方法采用抗原—抗体杂交Western杂交。具体做法是:

(1)将目的基因在工程菌(大肠杆菌)中表达出蛋白质;

(2)将表达出的蛋白质(相当于抗原)注射动物进行免疫,产生相应的抗体,并提取出特异性抗体(一抗);

(3)从待检测的转基因生物中提取蛋白质,走凝胶电泳;

(4)将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上固定;

(5)将抗体(一抗)与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交,这时抗体(一抗)与目的基因表达的蛋白(抗原)会特异结合。

由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带,所以加入一种称为二抗的抗体,它可以与一抗结合,二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质,则结果为阳性。

 

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