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DNA半保留复制的实验证据  

2012-11-10 08:33:51|  分类: 疑难分析 |  标签: |举报 |字号 订阅

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①Meselson和Stahl的实验
他们的同位素标记和密度梯度离心实验支持了半保留复制方式。
1958年Meselson和Stahl采用重同位素15N作DNA标记,而不用放射性同位素32P和14C。15N会导致DNA分子密度显著增加,这样可通过密度梯度离心将亲本链和子代链区分开来。
将大肠杆菌放在15NH4C1培养基中生长15代,使DNA被15N标记后,再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养。分别取0代、1代、2代、3代的细胞,提取DNA,进行密度梯度离心,分辨重链DNA、正常的轻链DNA和包含一条重链和一条轻链的DNA“杂种链”。

DNA半保留复制的实验证据 - 桓 - 桓

离心后从管底到管口DNA分子就停留在与其相当的CsC1密度处,紫外光下可以看到形成的区带。
14N-DNA密度较轻,停留在离管口较近的位置;15N-DNA密度较大停留在较低的位置。

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当含有15N-DNA的细胞在14NH4C1培养液中培养1代后,只有一条区带介于14N-DNA与15N-DNA之间。培养2代后则在14N-DNA区又出现一条带。有等量的“杂种链”和轻链密度。这些结果只与半保留复制模型相符。全保留模型可以排除,但分散模型却不能排除。Meselson等又将第1代的14N/15N杂种链变性使双链分开,再将变性前后的双链和单链分别进行CsCl密度梯度离心。变性前杂种双链只有一种带,密度为1.717g/cm3,变性后两条单链的密度不同而呈现了两条带,一条为15N带(1.740g/cm3),另一条为14N带(1.725g/cm3)。作为对照的是从肺炎球菌(D. pneumoniae)中提取的DNA,变性前后都只有一条带,密度为1.700g/cm3。这一结果完全符合半保留复制预期的结果,并否定了全保留模型和分散模型。

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按照半保留复制方式培养两代,只能出现14N和14N/15N两种DNA分子,随着代数的增加14N-DNA逐渐增加。而14N-15NDNA区带逐渐减弱。

②Taylor的实验
真核细胞的每条染色单体是由一条DNA双链组成,1958年Herbert Taylar用3H的胸腺密啶核苷酸处理蚕豆根尖细胞8小时,然后移入含有秋水仙素而没有标记放射性的培养液中。经标记处理后第一次分裂中期的染色体周围均显示放射性,每个染色体中有一条染色单体被标记,另一条染色单体未被标记。第二次分裂中期的染色体就只有一个显示有放射性,而另一个却没有。证明真核DNA复制也符合半保留模型。
DNA半保留复制的实验证据 - 桓 - 桓
 
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③姐妹染色单体差别染色方法(sister-chromatid differential staining)
在复制过程中用胸腺嘧啶的类似物5-尿嘧啶(5-Bromodeoxy uridine,BUdR)可掺入到新合成的DNA中。在两细胞周期之后,一条染色单体中含有DNA分子的双链都被BrdU取代,而另一条染色单体只有一条DNA单链中含有BrdU。若用荧光染料染色,DNA双股都含有Brdu的染色单体的荧光强度要小于DNA的单股含BrdU的染色单体的荧光强度,在荧光显微镜下可观察到两条姐妹染色单体的荧光强弱不同。

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若用Giemsa染色,当双链都插入5-BudR时则染不上Giemsa,而一条插入5-BudR则可染色。若细胞的培养基加入5-BudR则第二复制周期时,两条姊妹染色体染色状况不同,一明一暗,称花斑染色体。

 

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现代遗传学图片:http://ch.sysu.edu.cn/hope/sites/inherite/resource/recource2.htm

 

 

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